Naukowe artykuły oraz informacje

PCR – reakcja łańcuchowa polimerazy

187

dna3_1Rok 1983 był niezwykle łaskawy dla kalifornijskiej firmy Centus, a z całą pewnością dla jej pracownika – Kary’ego Mullisa. Opracował on bowiem technikę określaną jako reakcja łańcuchowa polimerazy, a w skrócie po prostu PCR. Wynalazek Kary’ego okazał się tak rewolucjonizujący, że w 1993 nasz bohater otrzymał nagrodę Nobla. Dowiedzmy się więc nieco więcej na temat metody, która zasłużyła sobie na wyróżnienie przyznawane za wybitne osiągnięcia naukowe.

Czym jest intrygująco brzmiąca reakcja łańcuchowa polimerazy? W skrócie – to sposób, aby uzyskać wiele kopii tej samej cząsteczki DNA. PCR przeprowadza się oczywiście w warunkach laboratoryjnych – proces jest poddawany nieustannej kontroli przez wyspecjalizowane maszyny oraz nadzorowi wyszkolonego personelu. Podczas reakcji w odpowiedni sposób steruje się temperaturą środowiska procesu – na przemian stosuje się wielokrotne ogrzewanie i oziębianie poddawanej powielaniu próbki.

Czego natomiast potrzebujemy, aby prawidłowo przeprowadzić reakcję PCR? Przede wszystkim niezbędne jest DNA matrycowe, a więc fragment materiału genetycznego, który ma zostać powielony. Należy także wprowadzić do mieszaniny reakcyjnej nukleotydy – swoisty materiał budulcowy nowej cząsteczki DNA, około 20-nukleotydowe primery (inaczej startery), które stanowią fragmenty rozpoczynające syntezę nowej nici oraz enzym aktywny niezależnie od wahań temperatur – termostabilną polimerazę DNA – głównego wykonawcę PCR. Jedną z częściej stosowanych polimeraz jest enzym izolowany z bakterii Thermus aquaticus – tak zwana polimeraza Taq.

Przyjrzyjmy się teraz samemu przebiegowi reakcji PCR. Jest on dość skomplikowany, aczkolwiek bardzo logiczny. Wyróżniamy trzy główne etapy w PCR – każdy z nich zachodzi w innej temperaturze. Etap pierwszy nosi miano denaturacji. Odbywa się w warunkach temperatury bardzo wysokiej – 95 stopni Celsjusza. Dochodzi wówczas do rozrywania wiązań, które w warunkach fizjologicznych utrzymują DNA jako strukturę dwuniciową i posiadającą formę helisy. Dzięki denaturacji dochodzi zatem do powstania DNA jednoniciowego. Następnie przychodzi czas na annealing, a więc dołączanie primerów do jednoniciowej matrycy materiału genetycznego. Proces ten zachodzi w temperaturze mieszczącej się w zakresie 45 – 60 stopni Celsjusza. Etap trzeci (około 72 °C) stanowi tak zwana elongacja. Jest to po prostu proces syntetyzowania cząsteczki DNA komplementarnej do jednoniciowej matrycy z nukleotydów obecnych w mieszaninie. Te trzy etapy powtarzają się podczas PCR wielokrotnie.

Gdzie reakcja łańcuchowa znajduje zastosowanie? W szeregu licznych dziedzin. Między innymi w badaniach nad genomami, diagnostyce poszczególnych schorzeń, kryminalistyce, ustalaniu ojcostwa, potwierdzaniu tożsamości osób zaginionych, w paleontologii, klonowaniu genów… Jak widać, Kary Mullis ułatwił rozwój wielu dziedzinom nauki.

Opracowano również pewne modyfikacje metody PCR, które w określonych przypadkach wydają się być skuteczniejsze i prostsze w wykonaniu. Do odmian PCR należą np. RT-PCR, ASA-PCR czy PCR-OLA.

Zostaw odpowiedź